Différenciation lymphocytaire B normale et tumorale

La différentiation lymphocytaire B qu'est-ce-que c'est ?

Nous étudions les mécanismes moléculaires et cellulaires qui conduisent, après contact avec un antigène, à la transformation d'un lymphocyte B naïf ou mémoire en cellule effectrice productrice d'anticorps, le plasmocyte.

Mise en place d'un système de différentiation in vitro et d'une stratégie intégrée :

Afin de disséquer précisément ces processus, nous avons mis en place un système de différenciation in vitro à partir de lymphocytes B extraits de poches de sang de l'EFS. Celui-ci nous permet :
1) de déterminer le rôle de l'interleukine 2 (IL-2) dans l'intégration précoce des signaux en provenance des différents récepteurs stimulés par l'antigène et les cytokines en provenance du micro-environnement (Tfh),
2) de décomposer les étapes de  différenciation et d'isoler les cellules progénitrices capables de devenir des plasmocytes,
3) de comprendre l'origine des capacités de différenciation accrues des lymphocytes B mémoires par rapport aux naïfs
4) d'appliquer ces résultats obtenus en situation physiologique saine à l'étude de pathologies tumorales dérivées de cellules du centre germinatif (lymphomes folliculaire et diffus), de cellules en cours de différenciation (maladie de Waldenström) ou des plasmocytes (myélome multiple).

 
Pour réaliser ces investigations, nous mettons en œuvre une stratégie intégrée basée sur des tris de populations cellulaires spécifiques, une caractérisation des propriétés cellulaires (cytométrie et microscopie confocale), de l'expression génique (transcriptomique par puces ADN ou RNA-seq) et de sa régulation (cartographie des marques d'histones, de la méthylation ou hydroxy-méthylation (5hmC) de l'ADN et du profil miRNA).

Nos récents résultats ont montré que :

1) l'IL-2 est nécessaire très tôt au cours de la stimulation des cellules et détermine la capacité future des cellules à se différencier en plasmocytes (Le Gallou et al. JI, 2012) ;
2) l'orientation des cellules vers une identité plasmocytaire est liée à leur capacité à se diviser, puis à réprimer les voies IL4 / STAT6 et TGFβ et enfin, au cours d'une ultime division, à favoriser l'expression des gènes d'identité plasmocytaire par l'adjonction de 5hmC à proximité ou dans leurs loci (Caron et al., Cell Rep, 2015) ;
3) la réponse rapide à l'IL-2 fait intervenir le facteur de transcription BACH2, principal verrou de la différenciation plasmocytaire (Symington et al., Nat Comm, en révision).

 
Différentiation des lymphocytes B normaux :

Des travaux visant à identifier les modifications génétiques et épigénétiques de la cellule B tumorales d’un lymphome folliculaire (LF) ou d’un lymphome B diffus à grandes cellules (LBDGC) sont également menées au sein de l’équipe. Ainsi, nous avons pu identifier lors de la mise en culture de cellules B de LF une hyper-signalisation phospho-STAT3 (pSTAT3) corrélée à une augmentation de la sécrétion de l’IL21 par les lymphocytes T helper folliculaires (Tfh) ; pourtant les gènes cibles de pSTAT3 ne répondent pas à cette stimulation. En effet, des mécanismes génétiques et épigénétiques empêchent la régulation des gènes de la voie de signalisation pSTAT3, en particulier le gène clé de la différenciation lymphocytaire, PRDM1. Notre travail met également en évidence l’impact fonctionnel des mutations des gènes (notamment le gène codant l’histone acétyle transférase, CREBBP) contrôlant les mécanismes épigénétiques dans les LF en dérégulant les transitions prolifération-différenciation : acétylation constitutive du répresseur de PRDM1, BCL6 concourant à l’inhibition forcée du gène PRDM1. Ce mécanisme épigénétique est en partie réversible par l’utilisation d’inhibiteur d’histone acétyltransférase (HDACi), favorisant la dé-acétylation des protéines.
En parallèle de ce travail, la technique de capture de gènes (SureSelect-Agilent, laboratoire Hématologie du CHU de Rennes) suivie du séquençage (Plateforme GEH Biosit / BioGenOuest implantée au CHU de Rennes) a été optimisée et permet de séquencer 43 gènes cibles fréquemment mutés dans les lymphopathies et jusqu’à 48 patients en une seule fois avec une couverture moyenne des régions cibles de 200X avec une qualité de séquençage supérieure à 90%. L’analyse bio-informatique des données de séquençage et la recherche de variants utilise un logiciel propriétaire dédié (SureCall, Agilent).

Dérégulation au cours de la lymphomagénèse :

Par ailleurs, nous nous intéressons à l'identification des miRNA impliqués dans le contrôle épigénétique de la différenciation lymphocytaire B terminale et, plus particulièrement, leur dérégulation au cours de lymphopoïèse. Par des approches combinées de miRseq et d'analyse de transcriptome sur cellules hautement purifiées, nous avons ainsi identifié des signatures d'expression de miRNA impliqués dans les transitions des stades de maturation/différenciation lymphocytaire B dans le centre germinatif du ganglion sain et une régulation spécifique de certains miRNA (en particulier de la famille miR-26 et miR-29) dans les cellules tumorales de lymphome folliculaire et dont l'étude plus approfondie devrait nous permettre d'avancer dans la compréhension des mécanisme de lymphomagenèse du LF.  

A la recherche de biomarqueurs sanguins :

Un axe plus translationnel accompagne aussi nos investigations scientifiques au travers d’exploration de cohortes de patients traités pour un lymphome. Notre recherche vise à identifier de nouveaux marqueurs sanguins pouvant revêtir un caractère diagnostique ou pronostique. Ainsi, nous explorons les cellules du sang, les protéines plasmatiques, l’ADN libre circulant  et aussi l’analyse des ARN totaux et miR du sang.
        Nos récents résultats ont montré que :

  1. la fraction soluble de PD-L1 par son aspect quantitatif peut avoir un impact pronostique dans le lymphome B diffus (Rossille et al., Leukemia, 2014 & 2017) ;
  2. les cellules mononuclées du sang pouvaient revêtir un caractère suppressif de la réponse anti-tumorale dans le lymphome B diffus (Azzaoui et al., Blood, 2016).
Publications
Azzaoui et al., Blood, 2016
T-cell defect in diffuse large B-cell lymphomas involves expansion of myeloid-derived suppressor cells. Azzaoui I, Uhel F, Rossille D, Pangault C, Dulong J, Le Priol J, Lamy T, Houot R, Le Gouill S, Cartron G, Godmer P, Bouabdallah K, Milpied N, Damaj G, Tarte K, Fest T, Roussel M. Blood. 2016 Aug 25;128(8):1081-92. PMID: 27338100

Caron et al., Cell Rep, 2015
Cell-Cycle-Dependent Reconfiguration of the DNA Methylome during Terminal Differentiation of Human B Cells into Plasma Cells. Caron G, Hussein M, Kulis M, Delaloy C, Chatonnet F, Pignarre A, Avner S, Lemarié M, Mahé EA, Verdaguer-Dot N, Queirós AC, Tarte K, Martín-Subero JI, Salbert G, Fest T. Cell Rep. 2015 Nov 3;13(5):1059-71. PMID: 26565917

Hipp et al., Nat Comm, 2017
IL-2 imprints human naive B cell fate towards plasma cell through ERK/ELK1-mediated BACH2 repression. Hipp N, Symington H, Pastoret C, Caron G, Monvoisin C, Tarte K, Fest T, Delaloy C.
Nat Commun. 2017 Nov 13;8(1):1443. PMID: 29129929

Le Gallou et al., JI, 2012
IL-2 requirement for human plasma cell generation: coupling differentiation and proliferation by enhancing MAPK-ERK signaling. Le Gallou S, Caron G, Delaloy C, Rossille D, Tarte K, Fest T. J Immunol. 2012 Jul 1;189(1):161-73. PMID: 22634617

Rossille et al., Leukemia, 2014
High level of soluble programmed cell death ligand 1 in blood impacts overall survival in aggressive diffuse large B-Cell lymphoma: results from a French multicenter clinical trial. Rossille D, Gressier M, Damotte D, Maucort-Boulch D, Pangault C, Semana G, Le Gouill S, Haioun C, Tarte K, Lamy T, Milpied N, Fest T; Groupe Ouest-Est des Leucémies et Autres Maladies du Sang; Groupe Ouest-Est des Leucémies et Autres Maladies du Sang. Leukemia. 2014 Dec;28(12):2367-75. PMID: 24732592

Rossille et al., Leukemia, 2017
Soluble programmed death-ligand 1 as a prognostic biomarker for overall survival in patients with diffuse large B-cell lymphoma: a replication study and combined analysis of 508 patients. Rossille D, Azzaoui I, Feldman AL, Maurer MJ, Labouré G, Parrens M, Pangault C, Habermann TM, Ansell SM, Link BK, Tarte K, Witzig TE, Lamy T, Slager SL, Roussel M, Milpied N, Cerhan JR, Fest T. Leukemia. 2017 Apr;31(4):988-991. PMID: 28035137